Obsah

• Kroky
• Tipy
• Varování
• Nezbytné materiály

Gramovo barvení je rychlý postup používaný k identifikaci přítomnosti bakterií ve vzorcích tkání a charakterizaci bakterií, jako je gram-pozitivní nebo gram-negativní na základě chemických a fyzikálních vlastností buněčných stěn. Toto barvení by mělo být téměř vždy provedeno jako první krok v diagnostice bakteriální infekce.

Procedura byla pojmenována po dánském vědci Hansu Christianovi Gramovi (1853 - 1938), který tuto techniku ​​vyvinul v roce 1882 a publikoval ji v roce 1884 jako proces rozlišení dvou typů bakterií s podobnými klinickými příznaky: Streptococcus pneumoniae (také známý jako pneumokok) a Klebsiella pneumoniae.

Kroky

Část 1 ze 3: Příprava sklíčka

1. 

   
   
   Připravte se na laboratorní práci. Nasaďte si rukavice a svlékněte dlouhé vlasy zpět, aby nedošlo ke kontaminaci testovaného vzorku. Dezinfikujte pracovní prostor pod kapotou chemického kouře nebo v jiné dobře větrané oblasti a před zahájením práce zkontrolujte, zda hořák a mikroskop Bunsen fungují.

2. 

   Sterilizujte sklíčko mikroskopu. Pokud je čepel znečištěná, umyjte ji mýdlem a vodou, abyste odstranili mastnotu a nečistoty. Dezinfikujte pomocí ethanolu, čističe na sklo nebo metodou doporučenou vaší laboratoří.

3. 

   
   
   Umístěte vzorek na sklíčko. Metodu Gramova barvení můžete použít k identifikaci bakterií přítomných v lékařských vzorcích nebo bakteriálních kulturách pěstovaných v Petriho misce. Aby byla metoda užitečná, vložte vrstvu štíhlý vzorku ve skvrně. Doporučuje se použít vzorek mladší než 24 hodin, protože starší bakterie mohou mít poškozené buněčné stěny, které budou na tento proces méně předvídatelné.
   • Pokud se chystáte použít vzorek tkáně, umístěte jednu až dvě kapky na sklíčko a rovnoměrně rozprostřete, abyste vytvořili jemné skvrny pomocí druhého sterilního sklíčka. Před pokračováním nechte uschnout na vzduchu.
   • Pokud používáte bakterie z Petriho misky, sterilizujte očkovací smyčku v Bunsenově hořáku, dokud se nerozsvítí, a poté ji nechte vychladnout. Použijte k umístění kapky destilované vody na podložní sklíčko a poté sterilizujte a znovu vysušte držadlo před přenesením malého vzorku bakterií a jemným promícháním ve vodě.
   • Bakterie ve vývaru by měly být smíchány na třepačce a poté přidány očkovací smyčkou, jak je uvedeno výše, bez přidání další vody.
   • Pokud máte vzorek tampónu, jemně jej otočte přes čepel.

4. 

   
   
   Opravte skvrnu pomocí tepla. Teplo fixuje bakterie na sklíčku tak, že je nelze během barvení snadno odplavit. Dvakrát nebo třikrát rychle protlačte čepel plamenem Bunsenova hořáku nebo ji zahřejte pomocí elektrického ohřívače čepele. Nepřehánějte to, protože vzorky můžete zkreslit. Pokud používáte hořák Bunsen, měl by být plamen malý modrý kužel, ne vysoký oranžový plamen.
   • Případně můžete skvrnu opravit přidáním jedné až dvou kapek methanolu do suché skvrny, odstraněním přebytečného produktu a necháním zaschnout na vzduchu. Tato metoda minimalizuje poškození hostitelských buněk a poskytuje čistší pozadí.

5. 

   Umístěte sklíčko na zásobník na barvení. Skládá se z ploché kovové, skleněné nebo plastové desky s malou obrazovkou nebo drátěnou podpěrou nahoře. Umístěte čepel na tuto podpěru tak, aby tekutiny, které používáte, mohly odtéct do zásobníku.
   • Pokud nemáte zásobník na zbarvení, lze sklíčko umístit přímo na plastovou ledovou vrstvu.

Část 2 ze 3: Dělat Gramovo barvení

1. 

   Skvrnu namočte do hořce fialové. Pomocí pipety namočte vzorek bakterií několika kapkami hořce fialové, někdy nazývané křišťálově fialová nebo methylová fialová. Počkejte 30 až 60 sekund. Gentian violet se disociuje ve vodných roztocích a vytváří CV + a Chlor (Cl–). Tyto ionty pronikají stěnou a membránou grampozitivních a gramnegativních buněk. Iont CV + interaguje s negativně nabitými složkami bakteriálních buněk a barví je fialově.
   • Mnoho laboratoří používá hořec fialový s oxalátem amonným, aby se zabránilo srážení.

2. 

   Jemně opláchněte hořec fialový. Nakloňte čepel a pomocí postříkání nalijte trochu čepu nebo destilované vody na čepel. Voda musí procházet povrchem skvrny, ale nesmí být nalita přímo na ni. Neoplachujte příliš mnoho, abyste se vyhnuli barvení grampozitivních bakterií.

3. 

   Namočte skvrnu jódem a opláchněte. Pomocí pipety zakryjte skvrnu jódem a nechte působit po dobu nejméně 60 sekund. Poté stejnou metodou pečlivě opláchněte. Jód, ve formě negativně nabitých iontů, interaguje s CV + a vytváří velké komplexy hořce fialové a jódové (komplexy CV - I) uvnitř vnitřní a vnější vrstvy buňky, zachycující fialovou barvu kdekoli je.
   • Jód je žíravý. Vyvarujte se vdechnutí, požití nebo kontaktu s kůží.

4. 

   Přidejte bělidlo a rychle opláchněte. Pro tento kritický krok se často používá směs acetonu a ethanolu 1: 1, která musí být pečlivě načasována. Držte čepel pod úhlem a přidávejte bělidlo, dokud fialová již není v tekutině, která vychází, viditelná. Proces obvykle trvá 10 sekund nebo méně, pokud bělidlo obsahuje vyšší koncentrace acetonu. Okamžitě zastavte, nebo bělidlo odstraní fialovou fialovou skvrnu z pozitivních a negativních buněk, což způsobí opakování testu. Ihned opláchněte předchozí techniku.
   • Místo směsi lze použít čistý aceton (> 95%). Čím více acetonu, tím rychleji bude bělidlo působit, což vyžaduje přesnější kontrolu času.
   • Pokud máte potíže s načasováním tohoto kroku, zvažte přidání bělidla po kapkách.

5. 

   Namočte skvrnu kontrastním barvivem a opláchněte. Kontrastní barvivo, obvykle safranin nebo fuchsin, se používá k přidání dalšího kontrastu mezi grampozitivními a gramnegativními bakteriemi barvením zbarvených (gramnegativních) růžových nebo červených bakterií. Nechejte působit nejméně 45 minut a opláchněte.
   • Fuchsin zabarví mnoho gramnegativních bakterií, jako je haemophilus spp a legionella spp, intenzivněji, což z něj činí lepší volbu pro začátečníky.

6. 

   Vysušte čepel. Můžete ji nechat uschnout ve větru nebo ji poklepat pomocí savého papíru prodaného za tímto účelem. Gramovo barvení skončilo.

Část 3 ze 3: Zkoumání výsledku

1. 

   Připravte optický mikroskop. Umístěte sklíčko pod mikroskop. Bakterie se mohou velmi lišit ve velikosti, takže celkové požadované zvětšení se může pohybovat od 400x do 1000x. Při vyšších hodnotách zvětšení se pro lepší přehlednost doporučuje použít objektiv, který je ponořen do oleje. Na čepel položte kapku imerzního oleje, abyste předešli přílišnému pohybu během aplikace, aby se zabránilo bublinám. Posuňte revolver mikroskopu tak, aby čočka objektivu zapadla na místo a dotkla se oleje.
   • Olejové ponoření lze použít pouze na speciální čočky, nikoli na „suché“ čočky.

2. 

   Identifikujte gram-pozitivní a gram-negativní bakterie. Prohlédněte sklíčko pod mikroskopem; Grampozitivní bakterie budou fialové díky gentian fialové uvízlé v jejich tlustých buněčných stěnách. Gram-negativy budou červené nebo růžové, protože fialová byla propláchnuta tenkými buněčnými stěnami a poté do nich vstoupilo růžové kontrastní barvivo.
   • Pokud je vzorek příliš silný, můžete vidět falešně pozitivní výsledky. Pokud jsou všechny typy bakterií grampozitivní, opakujte test s jiným vzorkem, abyste potvrdili výsledek.
   • Pokud bělidlo působí příliš dlouho, můžete vidět falešné negativy. Pokud jsou všechny typy bakterií gramnegativní, opakujte test s jiným vzorkem, abyste potvrdili výsledek.

3. 

   Hledejte referenční obrázky. Pokud si nejste jisti, jak bakterie vypadá, podívejte se na sbírku referenčních obrázků uspořádaných podle formátu a výsledku Gramova barvení. Online databáze najdete v databázi American Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos a na mnoha dalších stránkách. Abychom usnadnili identifikaci, uvádíme níže běžné nebo důležité příklady diagnostiky podle stavu a formátu.

4. 

   Identifikujte grampozitivní bakterie podle jejich tvaru. Bakterie jsou klasifikovány podle svého tvaru pod mikroskopem, nejčastěji jako kokosové ořechy (sférické) nebo bacily (válcové). Zde jsou některé běžné grampozitivní bakterie organizované podle formátu:
   • Grampozitivní kokosové ořechy jsou obvykle Stafylokoky (kokosové ořechy v klastrech) nebo Streptococci (řetězové kokosy).
   • Gram-pozitivní bacily zahrnout Bacil, Clostridium, Corynebacterium a Listeria. Bacily Actinomyces spp. často mají větve nebo vlákna.

5. 

   Identifikujte gramnegativní bakterie. Gram-negativy (růžové) jsou často klasifikovány do tří skupin: kokosové ořechy jsou kulovité, bacily jsou dlouhé a tenké a kokosové bacily jsou uprostřed.
   • Gramnegativní kokosové ořechy jsou nejčastěji Neisseria spp.
   • Gramnegativní bacily zahrnout E-coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas a mnoho dalších. Bakterie Vibrio cholerae může to vypadat jako obyčejné nebo zakřivené bacily.
   • Gramnegativní kokosové bacily (nebo „cocobacilli“) zahrnout Bordetella, Brucella, Haemophilus a Pasteurella.

6. 

   Vyhodnoťte smíšené výsledky. Některé bakterie je obtížné obarvit právě kvůli křehkosti nebo voskovitému vzhledu buněčných stěn. Mohou mít směs fialové nebo růžové ve stejné buňce nebo mezi různými buňkami ve stejném vzorku. Tento problém může mít jakýkoli vzorek bakterií starších než 24 hodin, ale některé druhy je obtížné zbarvit v každém věku a vyžadují specializovanější testy ke snížení identifikace, jako je Ziehl-Neelsenova technika, pozorování růstu kultury, TSI agar nebo genetické testování.
   • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium a Propionibacterium spp. všichni jsou považováni za gram-pozitivní bakterie, ale často nemusí přinést přesvědčivé výsledky tohoto testu.
   • Malé, tenké bakterie jako Treponema, Chlamydia a Rickettsia spp. pomocí této techniky je obtížné správně obarvit.

7. 

   Zbavte se materiálů. Postupy likvidace odpadu se liší v závislosti na laboratoři a použitých materiálech. Kapalina v barvicí misce se obvykle zlikviduje v uzavřených lahvích jako nebezpečný odpad. Čepele ponořte do 10% bělicího roztoku a poté je vyhoďte do nádob pro likvidaci ostrých materiálů.

Tipy

• Nezapomeňte, že Gramovo barvení je stejně dobré jako vzorek. Je důležité naučit pacienty, aby poskytovali dobré vzorky ukazující například rozdíl mezi plivavostí a hlubším hlenem ve vzorcích sputa.
• Jako bělidlo působí ethanol pomaleji než aceton.
• Dodržujte standardní laboratorní opatření.
• Procvičte vzorek výtěru, protože by měl obsahovat gram-pozitivní a gram-negativní bakterie. Pokud vidíte pouze jeden nebo druhý typ, pravděpodobně používáte příliš mnoho nebo příliš málo bělidla.
• Pro vyzvednutí čepele můžete použít dřevěný kolíček na prádlo s pružinou.

Varování

• Aceton a ethanol jsou hořlavé a první z nich odstraní z ruky oleje, díky čemuž vaše pokožka snáze absorbuje jiné chemické složky. Používejte rukavice a buďte opatrní.
• Před oplachováním skvrn nebo skvrn nenechte vzorek zaschnout.

Nezbytné materiály

• Vzorek látky
• Skleněné sklíčka
• Pipeta
• Zdroj plamene, žhavicí kotouč nebo metanol
• Voda
• Gentian Violet
• Jód
• Bělicí činidlo, jako je alkohol nebo aceton
• Safranina